-
Notifications
You must be signed in to change notification settings - Fork 0
/
Copy pathindex.html
858 lines (563 loc) · 33.9 KB
/
index.html
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
248
249
250
251
252
253
254
255
256
257
258
259
260
261
262
263
264
265
266
267
268
269
270
271
272
273
274
275
276
277
278
279
280
281
282
283
284
285
286
287
288
289
290
291
292
293
294
295
296
297
298
299
300
301
302
303
304
305
306
307
308
309
310
311
312
313
314
315
316
317
318
319
320
321
322
323
324
325
326
327
328
329
330
331
332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
342
343
344
345
346
347
348
349
350
351
352
353
354
355
356
357
358
359
360
361
362
363
364
365
366
367
368
369
370
371
372
373
374
375
376
377
378
379
380
381
382
383
384
385
386
387
388
389
390
391
392
393
394
395
396
397
398
399
400
401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
411
412
413
414
415
416
417
418
419
420
421
422
423
424
425
426
427
428
429
430
431
432
433
434
435
436
437
438
439
440
441
442
443
444
445
446
447
448
449
450
451
452
453
454
455
456
457
458
459
460
461
462
463
464
465
466
467
468
469
470
471
472
473
474
475
476
477
478
479
480
481
482
483
484
485
486
487
488
489
490
491
492
493
494
495
496
497
498
499
500
501
502
503
504
505
506
507
508
509
510
511
512
513
514
515
516
517
518
519
520
521
522
523
524
525
526
527
528
529
530
531
532
533
534
535
536
537
538
539
540
541
542
543
544
545
546
547
548
549
550
551
552
553
554
555
556
557
558
559
560
561
562
563
564
565
566
567
568
569
570
571
572
573
574
575
576
577
578
579
580
581
582
583
584
585
586
587
588
589
590
591
592
593
594
595
596
597
598
599
600
601
602
603
604
605
606
607
608
609
610
611
612
613
614
615
616
617
618
619
620
621
622
623
624
625
626
627
628
629
630
631
632
633
634
635
636
637
638
639
640
641
642
643
644
645
646
647
648
649
650
651
652
653
654
655
656
657
658
659
660
661
662
663
664
665
666
667
668
669
670
671
672
673
674
675
676
677
678
679
680
681
682
683
684
685
686
687
688
689
690
691
692
693
694
695
696
697
698
699
700
701
702
703
704
705
706
707
708
709
710
711
712
713
714
715
716
717
718
719
720
721
722
723
724
725
726
727
728
729
730
731
732
733
734
735
736
737
738
739
740
741
742
743
744
745
746
747
748
749
750
751
752
753
754
755
756
757
758
759
760
761
762
763
764
765
766
767
768
769
770
771
772
773
774
775
776
777
778
779
780
781
782
783
784
785
786
787
788
789
790
791
792
793
794
795
796
797
798
799
800
801
802
803
804
805
806
807
808
809
810
811
812
813
814
815
816
817
818
819
820
821
822
823
824
825
826
827
828
829
830
831
832
833
834
835
836
837
838
839
840
841
842
843
844
845
846
847
848
849
850
851
852
853
854
855
856
857
858
<!DOCTYPE html>
<html>
<head>
<title>Eukarüootne rakutsükli regulatsioon</title>
<meta charset="utf-8">
<meta name="author" content="Taavi Päll" />
<meta name="date" content="2017-11-14" />
<link href="index_files/remark-css-0.0.1/example.css" rel="stylesheet" />
</head>
<body>
<textarea id="source">
class: center, middle, inverse, title-slide
# Eukarüootne rakutsükli regulatsioon
### Taavi Päll
### 2017-11-14
---
class: inverse
background-image: url(figures/chapter_20_opener.jpg)
.footer[
A two-cell *C. elegans* embryo stained with anti-tubulin (red), anti-CeBUB-1 spindle checkpoint protein (green). DNA is stained with DAPI (blue).
]
---
## Rakutsükkel
- Rakutsükkel on järjestikuste sündmuste jada mille käigus rakk duplitseerib kõik oma koostisosad ja jaguneb kaheks tütarrakuks
- Rakutsüklit kontrolliv 'masinavärk' on universaalne kõigis organismi rakutüüpides
- Kõrgematel organismidel reguleerivad raku rakutsüklisse sisenemist ja 'masinavärgi käivitamist' raku väliskeskkonna signaalid
---
## Rakutsükli faasid
.pull-left[
- **G1** algab peale mitoosi ja kestab kuni DNA replikatsiooni alguseni S faasis,
- rakk kasvab ja valmistub sisenema S faasi
- toimub ettevalmistus S-faasiks – pre-replikatsiooni komplekside moodustumine
- **S-faas**is toimub genoomse DNA süntees
- **G2 faas** on intervall DNA sünteesi eduka lõpu ja mitoosis toimuva kromosoomide lahknemise vahel
- suhteliselt lühike
- mitoosis vajalike valkude süntees
- **M-faas** mitoos
]
.pull-right[
<img src="figures/figure_20-01.jpg" width="\linewidth" style="display: block; margin: auto;" />
]
---
## Rakutsükli läbimist kontrollib reguleeritud valkude fosforüleerimine ja lagundamine
- Rakutsüklit reguleerivad tsükliin -- tsükliin sõltuvad kinaasid (tsükliin-kinaas, *cyclin/CDK*)
- Igas rakutsükli faasis on aktiivne spetsiifiline tsükliin-kinaas
- Tsükliin-kinaase on kolm rühma: G1 tsükliin-kinaasid (D/4,6; E/2), S faasi tsükliin-kinaasid (A/2) ja mitoosi tsükliin-kinaasid (B/CDC2)
- Rakutsüklis on olulised kaks ubikvitiin ligaasi kompleksi SCF ja APC (*anaphase promoting complex - cyclosome*)
- Rakutsükli kontrollpunktid (*checkpoints*) monitoorivad, et rakutsükli faaside üleminekuks oleks eelnev faas edukalt ja kvaliteetselt läbitud
---
## Rakutsükli läbimist kontrollib reguleeritud valkude fosforüleerimine ja lagundamine
<img src="figures/figure_20-02.jpg" width="460" style="display: block; margin: auto;" />
---
## G1 tsükliinid/CDK
- G1 cyclin/CDK kompleksid foforüleerivad ja reguleerivad transkriptsioonifaktoreid mis kontrollivad genoomi replikatsiooniks vajalike geenide ekspressiooni
- nukleotiidide sünteesiraja ensüümid,
- DNA polümeraasid jt.
- Kõrgematel organismidel reguleerivad rakutsüklit rakuvälised signaalid:
- eksponentsiaalselt kasvav imetajarakk peab peale igat raku jagunemist otsustama,
- kas kasvada ja jaguneda veel üks tsükkel või jääda vaikeolekusse.
- Seda otsust mõjutavad mitogeensed kasvufaktorid -- kui neid on piisavalt siis rakk jätkab jagunemist, vastasel juhul jääb rakk vaikeolekusse -- või toitainestaatus (pärm)
---
## S-faasi tsükliinid/CDK
- Sünteesitakse hilises G1 faasis, kuid on siis tsükliin-kinaasi inhibiitorite poolt inhibeeritud
- G1 tsükliinide täisaktiivsuse saavutamisel fosforüleeritakse S-faasi CDK inhibiitoreid ja saadetakse proteolüütilisse lagundamisse
- Aktiveeritud S faasi tsükliin-kinaasid aktiveerivad replikatsiooni oridele assambleeritud pre-replikatsioonikompleksid ja initseeritakse DNA replikatsioon
---
## M-faasi tsükliinid/CDK
- Sünteesitakse hilises S ja G2 faasis, kuid on inhibeeritud läbi inhibitoorsete aa saitide fosforülatsiooni
- Aktivatsioonil fosforüleerib paljusid valke,
- mis on seotud kromatiini kondensatsiooniga,
- tuumamembraani ja tuumapoori kompleksi valke,
- mikrotuubulitega assotseerunud valke,
- käävi valke
---
## Rakutsükli kontrollpunktid e *checkpoints*
1. G1-S DNA kahjustuste kontrollpunkt: S-faasi sisenemine on blokeeritud kui genoom on vigane
2. S-faasi kontroll: replikatsioon aeglustub või seiskub vastusena DNA kahjustustele
3. G2-M kontroll blokeerib raku mitoosi sisenemise kuni genoomi replikatsioon S-faasis on lõpule viidud
4. Hilise G2 dekatenatsiooni kontroll mis monitoorib, et kromosoomid ei oleks omavahel 'sõlmes'
5. M faasis kontrollpunkt mis blokeerib sisenemise anafaasi kuni kõik kromosoomid on korrektselt käävile kinnitunud
---
class: inverse, middle, center
# Eksperimentaalsed süsteemid
---
## Imetajarakud: lahustuv faktor reguleerib rakutsüklit
Kui G1, S või G2 faasi rakud fuseeriti M-faasi rakkudega, siis lagunes neil tuumamembraan ja kromosoomid hakkasid kondenseeruma
<img src="figures/figure_20-03a.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
G1, S või G2 faasi rakkude fuseerumisel M-faasi rakkudega viib neil kromosoomide kondenseerumiseni
<img src="figures/figure_20-03b.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## S-faasis rakud indutseerivad DNA replikatsiooni
- S-faasis olevate rakkude fuseerimisel G1 rakkudega indutseerivad DNA sünteesi
- S-faasis olevate rakkude fuseerimisel G2 rakkudega aga DNA sünteesi ei indutseerita
--
- Nüüd me teame, et S-faasi tsükliin-kinaas aktiveerib prereplikatsiooni kompleksid, mis on olemas küll G1 tuumas kuid puuduvad juba S-faasi läbinud rakkudes
---
## Pärmi geneetika
- _Saccharomyces cerevisiae_ ja _Schizosaccharomyces pombe_ jagunemisdefektidega mutandid aitasid identifitseerida rakutsüklit reguleerivad faktorid
- Mõlemal pärmil esinevad **temperatuurisensitiivsed** rakutsükli mutandid mida on võimalik mikroskoopia abi detekteerida
- Selliseid rakutsükli mutante nimetatakse __cdc__ ( _cell-division cycle_ )
---
## Funktsionaalne komplementatsioon
<img src="figures/figure_20-04.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## Pärmist isoleeritud rakutsükli regulaatorid
<img src="figures/table_20-01_part_1.jpg" width="50%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## Pärmi regulaatorite selgroogsete homoloogid
<img src="figures/table_20-01_part_2.jpg" width="50%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## Xenopuse mudel
- Biokeemilisteks uuringuteks on vaja palju materjali
- Amfiibide ja mereselgrootute munad ja varajase embrüo rakud läbivad esimesed jagunemised sünkroonis,
- mis võimaldab eraldada palju materjali samas rakutsükli faasis olevatest rakkudest
---
## Mitoosi kontroll MPF ja tsükliinide poolt
- _Xenopus laevise_ ootsüütide küpsemise mudel võimaldas identifitseerida mitoosi indutseeriva faktori
- Konna ootsüüdid replitseerivad oma DNA ja arresteeruvad G2 faasis 8 kuuks, kasvades sel ajal umbes 1 mm suuruseks
- Isase konna poolt stimuleeritakse emasel progesterooni vabanemine ja G2 ootsüüdid läbivad esimese meioosi ja jäävad teise meioosi metafaasi
- Selles faasis olevaid rakke nimetatakse __munadeks__
- Viljastamisel läbib muna meioosi lõpuni
- Viljastatud muna haploidne __pronukleus__ fuseerub haploidse spermi pronukleusega
- Järgnevad 11 sünkroonset rakutsüklit, peale mida jagunemine aeglustub ja muutub asünkroonseks
<img src="figures/figure_20-05a.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
<img src="figures/figure_20-05b.jpg" width="90%" style="display: block; margin: auto;" />
.footer[Xenopuse ootsüüdid]
---
## Progesteroon indutseerib küpsemise ka in vitro
<img src="figures/figure_20-06.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## MPF aktiivsus ootsüütides
<img src="figures/figure_20-07.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## Tsükliline valgusüntees merisiilikus
- Radioakatiivselt märgistatud valgulüsaadid näitavad tsüklilist valgusünteesi ja lagundamist
<img src="figures/figure_20-08.jpg" width="50%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## Kinaasne aktiivsus
- MPF on võimeline ka fosforüleerima histoon H1-te ja see toimub sünkroonis tsükliini tasemega
- Mitoos on sõltuv tsükliin B-st
<img src="figures/figure_20-09.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
class: inverse, middle, center
# Rakutsükli kinaasid
---
## Rakutsükli masinavärki reguleerivad kinaasid
Rakutsükli kinaaside (**CDK**) substraadid:
- Tsentrosoomi valke (CP110) fosforüleeritakse G1/S üleminekul tsentrosoomi duplitseerumiseks
- Enne S-faasi aktiveeritakse replikatsioonikompleks (Treslin)
- Histoonide fosforüleerimine S ja M faasis kromatiini kondenseerumiseks.
- Tuumamebraani valkude (Lamiin) fosorüleerimine põhjustab tuumamembraani lagunemise M-faasis
---
## Rakutsükli kinaasid (CDK)
- CDK on Ser/Tre-kinaasid.
- 40% aa järjestusest identsed.
- **CDK aktiveerub seostumisel tsükliiniga**
- tsükliin E + CDK2 kompleksi kinaasne aktiivsus tõuseb 400000 korda.
- Tsükliinid tagavad ka substraat spetsiifilisuse.
<img src="figures/A-CDK2anno.png" width="400" style="display: block; margin: auto;" />
.footer[Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclinA-CDK2 complex. Jeffrey, P.D., Russo, A.A., Polyak, K., Gibbs, E., Hurwitz, J., Massague, J., Pavletich, N.P. (1995) Nature 376: 313-320]
---
## Iga tsükliin paardub kindla kinaasiga kindlas rakusükli faasis
.pull-left[
<img src="http://www.nature.com/nrc/journal/v13/n3/images/nrc3468-f1.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
]
.pull-right[
<table class="table table-striped" style="font-size: 10px; ">
<thead><tr>
<th style="text-align:left;"> Tsükliini kinaas </th>
<th style="text-align:left;"> Tsükliin </th>
<th style="text-align:left;"> Rakutsükli faas </th>
</tr></thead>
<tbody>
<tr>
<td style="text-align:left;"> CDK4/6 </td>
<td style="text-align:left;"> D1, D2, D3 </td>
<td style="text-align:left;"> varane G1 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> CDK2 </td>
<td style="text-align:left;"> E1, E2 </td>
<td style="text-align:left;"> hiline G1, G1/S üleminek </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> CDK2 </td>
<td style="text-align:left;"> A </td>
<td style="text-align:left;"> S </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> CDC2 (CDK1) </td>
<td style="text-align:left;"> A </td>
<td style="text-align:left;"> S/G2 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> CDC2 </td>
<td style="text-align:left;"> B </td>
<td style="text-align:left;"> M </td>
</tr>
</tbody>
</table>
]
---
## Tsükliinide hulk rakus muutub rakutsükli käigus
- Tsükliine kontrollitakse läbi proteolüütilise lagundamise.
- Tsükliini järkjärguline tõus ja kiire lagundamine tagab rakutsükli 'hammasrataste' liikumise ühes sunas.
- **D-tsükliinid erinevad: nende puhu ei toimu järske kõikumisi rakutsükli käigus**
- **D-tsükliinid on reguleeritud mitogeensete signaalide poolt**
<img src="http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/ce/Cyclin_Expression.svg/1280px-Cyclin_Expression.svg.png" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
---
## Rakutsükkel liigub ühes suunas
Tuuma tsükkel on koordineeritud raku kasvu ja pooldumisega.
- Replikatsioon peab toimuma vaid üks kord rakutsükli jooksul.
- Replikatsioon peab eelnema kromosoomide lahknemisele.
- Kromosoomide lahknemine peab omakorda olema toimunud enne tsütokineesi e. raku jagunemist.
---
## Genoomi replitseeritakse ainult üks kord
**Rad17** sensorvalgu fosfrüleerimine ATRi poolt on vajalik DNA-kahjustuste ja __üheahelalise DNA__ poolt indutseeriud G2-faasi blokiks
.pull-left[
Komosoomi aberratsioonid RAD17 flox/− rakkudes. Metafaasi komosoomid:
- Katkenud komosoomid (all vasak, nool)
- Endoreduplitseerunud kromosoomid (all parem)
]
.pull-right[
<img src="http://genesdev.cshlp.org/content/17/8/965/F4.medium.gif" width="200" style="display: block; margin: auto;" />
]
---
## Replikatsiooni kontrollpunkt
.pull-left[
]
.pull-right[
- **Seriin-treoniin kinaas ATR** tagab fragiilsete saitide stabiilsuse
- ATR aktiveeritakse vastuseks üheahelalisele DNA-le
- Aktiveeritud ATR fosforüleerib CHK1 kinaasi ja käivitatakse signaalirada mis viib rakutsükli blokini
]
---
## Käävi kontrollpunkt
Mitoosikäävi kontrollpunkt (*spindle assembly checkpoint*, SAC) hoiab ära aneuploidia tekke
.pull-left[
- **BUB1** mutatsioonid põhjustavad kromosomaalse ebastabiilsuse ja aneuploidsuse, üle 90% tahketest kasvajatest sisaldab kromosomaalseid aberratsioone.
- Bub1 on Ser/Tre-kinaas mis fosforüleerib ja inhibeerib APC/C kompleksi. APC/C on vajalik sekuriini Ub-sõltuvaks lagundamiseks, mistõttu vabaneb separaasi aktiivsus ja õdekromatiidid vabastatakse neid koos hoidvatest kohesiin 'rõngastest'.
]
.pull-right[
See BUB1-vaigistatud rakk on kaotanud kromosoomid 1 ja 6.
<img src="figures/F5.large.jpg" width="500" style="display: block; margin: auto;" />
]
---
## G1 restriktsioonipunkt
Tagab mitogeense kontrolli rakutsükli kulgemise üle
- Varases ja keskmises G1 faasis on S-faasi sisenemine seerumsõltuv.
- Samuti on rakud tundlikud TGF-beta anti-mitogeensele toimele.
- Hilises G1 faasis on rakud juba pühendunud S-faasi sisenemisele ja ei sõltu enam rakuvälistest signaalidest.
---
## Erinevad mitogeensed rajad konvergeeruvad tsükliin D regulatsioonil
Kasvufaktorid stimuleerivad kiire tsükliin D taseme tõusu rakus, samuti kasvufaktorite 'ära võtmine' koekultuuri tingimustes viib tsükliin D lagundamiseni (poolestuseg ~30 min).
Kasvufaktorite rajad mis kontrollivad tsükliin D ekspressiooni:
- GF `\(\rightarrow\)` **türosiin kinaas reseptorid** `\(\rightarrow\)` Ras `\(\rightarrow\)` Raf/RalGDS `\(\rightarrow\)` Fos/Jun `\(\rightarrow\)` D1
- GF `\(\rightarrow\)` **HER2/Neu** `\(\rightarrow\rightarrow\rightarrow\)` Sp1 `\(\rightarrow\)` D1
- **Wnt** `\(\rightarrow\)` **beta-kateniin** `\(\rightarrow\)` Tcf/Lef `\(\rightarrow\)` D1
- Tsütokiinid `\(\rightarrow\)` tsütokiini retseptorid `\(\rightarrow\)` **Jak `\(\rightarrow\)` STAT** `\(\rightarrow\)` D1
- **Hedgehog** `\(\rightarrow\)` Patched `\(\rightarrow\)` Smoothened `\(\rightarrow\)` **Gli** `\(\rightarrow\)` D1
- Erinevad ligandid `\(\rightarrow\)` erinevad retseptorid `\(\rightarrow\)` IKK `\(\rightarrow\)` **NF-kB** `\(\rightarrow\)` D1
---
## Kolme D-tüüpi tsükliini induktsioonimuster erineb
<table class="table table-striped">
<thead><tr>
<th style="text-align:left;"> Signaali allikas </th>
<th style="text-align:left;"> Signaalirada </th>
<th style="text-align:left;"> D tsükliini isovorm </th>
</tr></thead>
<tbody>
<tr>
<td style="text-align:left;"> RANK retseptor </td>
<td style="text-align:left;"> NF-kB </td>
<td style="text-align:left;"> D1 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> Prolaktiini retseptor </td>
<td style="text-align:left;"> Jak/Stat </td>
<td style="text-align:left;"> D1 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> Östogeeni retseptor </td>
<td style="text-align:left;"> AP1 (Fos/Jun) </td>
<td style="text-align:left;"> D1 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> Focal adhesion kinase </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> D1 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> HER2/Neu </td>
<td style="text-align:left;"> E2F ja Sp1 </td>
<td style="text-align:left;"> D1 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> Wnt-Frizzled </td>
<td style="text-align:left;"> beta-kateniin-Tcf/Lef </td>
<td style="text-align:left;"> D1 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> Bcr/Abl </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> D2 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> FSH retseptor </td>
<td style="text-align:left;"> cAMP </td>
<td style="text-align:left;"> D2 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> erinevad mitogeenid </td>
<td style="text-align:left;"> Myc </td>
<td style="text-align:left;"> D2 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> IL-4/7 retseptor </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> D2 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> IL-5 retseptor </td>
<td style="text-align:left;"> STAT3/5 </td>
<td style="text-align:left;"> D3 </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> E2F transkriptsiooni faktorid </td>
<td style="text-align:left;"> D3 </td>
</tr>
</tbody>
</table>
---
## Tsükliin D1 regulatsiooni mehhanismid
GF-Ras-Raf-Erk ja Wnt signaalirada kontrollib tsükliin D1 ekspressiooni ning stabiilsust ja GSK3beta on siin negatiivne regulaator.
- Stabiilne 5–6 tundi kestev ERK signalisatsioon indutseerib tsükliin D1 ekspressiooni kesk-G1 faasis (~8–9 tundi peale mitogeense stimulatsiooni algust vaikeolekus rakkudes)
- PI3-kinaas/Akt fosforüleerib glükogeen süntaasi kinaasi 3beta (GSK3beta) ja inhibeerib selle aktiivsuse
- GSK3beta fosforüleerib tsükliin D1 Thr286 mistõttu see translokeerub tuumast tsütoplasmasse ja satub lagundamisele
- Teisalt indutseerib Wnt signaalirada D1 ekspressiooni läbi beta-kateniini
- beta-kateniini lagundamist kontrollib samuti GSK3beta
- lisaks kontrollib GSK3beta p27Kip1 degradatsiooni
---
## Tsükliin D-CDK4/6 lükkavad raku läbi Restriktsiooni-punkti
- Rakud vastvad rakuvälistele mitogeensetele signaalidele kuni R-punktini
- **Peale R-punkti läbimist on tsükliinide E `\(\rightarrow\)` A `\(\rightarrow\)` B regulatsioon automaatne ja autonoomne**
---
## CDK inhibiitorid
Lisaks tsükliinidele reguleerivad tsükliin-sõltuvaid kinaase ka CDK inhibiitorid (CdkI).
Praeguseks on kirjeldatud seitse erinevat CdkI-d
- INK4 valgud (**in**hibitors of CD**K4**), mis inhibeerivad spetsiifiiselt ainult CDK4 ja CDK6
- p16<sup>INK4A</sup> , p15<sup>INK4B</sup>, p18<sup>INK4C</sup>, p19<sup>INK4D</sup>
- p21<sup>Cip1</sup>, p27<sup>Kip1</sup>, p57<sup>Kip2</sup>: inhibeerivad kõiki teisi tsükliin-CDK komplekse
<img src="figures/p16-p27mech.png" width="400" style="display: block; margin: auto;" />
.footer[Crystal structure of the p27Kip1 cyclin-dependent-kinase inhibitor bound to the cyclin A-Cdk2 complex. Russo, A.A., Jeffrey, P.D., Patten, A.K., Massague, J., Pavletich, N.P. (1996) Nature 382: 325-331. Structural basis for inhibition of the cyclin-dependent kinase Cdk6 by the tumour suppressor p16INK4a. Russo, A.A., Tong, L., Lee, J.O., Jeffrey, P.D., Pavletich, N.P. (1998) Nature 395: 237-243.]
---
## TGF-b indutseerib p15<sup>INK4B</sup>
- **TGF-beta peamine raku jagunemist pidurdav mehhanism töötab läbi p15<sup>INK4B</sup>**
- p15<sup>INK4B</sup> blokeerib tsükliin D-CDK4/6 komplekside moodustumise ja inhibeerib olemasolevaid
- Ilma aktiivse tsükliin D-CDK4/6 pole rakutsükkel võimeline arenema läbi varase ja keskmise G1 faasi R-punktini
- Kui rakk on juba R-punkti läbinud pole enam D-CDK4/6 aktiivsus vajalik
- Peale R-punkti muutub rakk 'tundetuks' ka TGF-b inhibeerivale toimele
- [CDKN2A/B lookuse naabruses asuv 9p21.3 lookus on üks sagedamini muteerunud piirkondi eri tüüpi vähkides](http://rpubs.com/tapa741/tuumorsupressorgeenid) (vt. Supplementary Table 3)
---
## p21<sup>Cip1</sup> aktiveeritakse vastusena stressile
- p21<sup>Cip1</sup> toimib läbi terve rakutsükli
- TGF-beta indutseerib nõrgalt ka p21<sup>Cip1</sup>
- **Peamine p21<sup>Cip1</sup> induktor on DNA kahjustused**
- p21<sup>Cip1</sup> inhibeerib E-CDK2, A-CDK2, A-CDC2, B-CDC2 komplekse
- Kui DNA kahjustused on parandatud, siis võetakse p21^Cip1 -blokk maha
- p21<sup>Cip1</sup> inhibeerib ka DNA replikatsiooni masinavärgi valku PCNA (*proliferating cell nuclear antigen*)
<img src="http://www-bioc.rice.edu/~shamoo/threeclamps.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
.footer[Pilt: p21 (A, punane) blokeerib PCNA-l (sliding clamp) DNA polümeraasi seostumiskoha (B, C). http://www-bioc.rice.edu ]
---
## Mitogeenne signalisatsioon inhibeerib p21<sup>Cip1</sup> ja p27<sup>Kip1</sup>
**PKB/Akt inhibeerib p21<sup>Cip1</sup> ja p27<sup>Kip1</sup> tuuma lokalisatsiooni**
- Akt seostub p21<sup>Cip1</sup> ja fosforüülib selle Tre-145, põhjustades tsütoplasma lokalisatsiooni
- Akt raja blokeerimine dominant-negatiivse Akt mutandiga taastab p21Cip1 tuuma lokalisatsiooni ja rakkude jagunemist inhibeeriva toime
- Sarnaselt toimub p27<sup>Kip1</sup> inhibitsioon, seal fosforüülib Akt Tre-157
- Aktiveeritud Akt ekspresseerivad rakkudes ei suuda p27WT tekitada G1 arresti
- Tsütoplasmaatiline p27 esines 41% (52/128) inimese primaarsetes rinnavähkides kus on kõrge Akt aktivatsiooni, HER-2/neu-vahendatud raku jagunemine käib läbi Akt kinaasi ([Liang et al. 2002](http://www.nature.com/nm/journal/v8/n10/full/nm761.html))
- Tsütoplasmaatiline p27 korreleerub halva prognoosiga
---
## p21<sup>Cip1</sup> ja p27<sup>Kip1</sup> seostumine on vajalik D-CDK4/6 aktivatsiooniks
.pull-left[
- Primaarsed hiire fibroblastid, milles puuduvad nii p21 ja p27 ei suuda moodustada aktiivseid tsükliin D-CDK komplekse,
- ekspresseerivad palju vähem tsükliin D ning
- neis ei lokaliseeru tsükliin D tuuma
- Tsükliin D-CDK4/6 tase tõuseb rakus varases-keskmises G1 faasis ja korjab ära p21 ja p27 nii, et see ei saa inhibeerida tsükliin E-CDK2
]
.pull-right[
p21/p27 dko rakkudes on vähem tsükliin D-CDK komplekse [Cheng et al. 1999](http://emboj.embopress.org/content/18/6/1571.long).
<img src="http://emboj.embopress.org/content/embojnl/18/6/1571/F8.large.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
]
---
## CDK inhibiitorid imetajarakkude rakutsüklis
<div class="figure" style="text-align: center">
<img src="http://physrev.physiology.org/content/physrev/85/2/523/F3.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1" alt="Schematic representation of the mammalian cell cycle." width="500" />
<p class="caption">Schematic representation of the mammalian cell cycle.</p>
</div>
.footer[Pilt: Physiological Reviews. DOI: 10.1152/physrev.00055.2003 ]
???
The cyclin D/cdk4–6 complex phosphorylates the Rb protein leading to sequential phosphorylation by cyclinE/cdk2 and the release of free E2F. Phosphorylation of Rb relieves transcriptional repression of genes involved in the induction of S-phase entry. The ability of the cyclin/cdk enzymes to phosphorylate Rb is inhibited by cyclin-dependent kinase inhibitors (cdkis), the activation of which thus suppresses cell proliferation. The basic helix-loop-helix (bHLH) proneural genes NeuroD, Mash1, and Ngn1 control the switch from cell proliferation to neural differentiation by activation of the Kip/Cip Cdki family, thus preventing progression through the G1-S phases. The HLH proteins Id1 and Id3 (inhibitor of differentiation) repress neuronal determination by direct binding with proneural bHLH proteins, but also favor progression through the cell cycle via inhibition of the INK4 and Kip/Cip Cdki families. Activating and inhibiting influences are represented by blue arrows and red lines, respectively.
---
class: inverse, middle, center
# pRb ja restriktsioonipunkti kontroll
---
## Viiruste onkogeenid seovad pRb-d
- pRb tuumorsupressor tundub viirustele olulise märklauana:
- Inimese adenoviirus tüüp-5 E1A onkogeen seob pRb-d
- HPV E7 seob pRb-d
- SV40 largeTAg seob pRb
- Need viiruste onkogeenid seovad hüpofosforüleeritud pRb valku
- hüpofosforüleeritud pRb on funktsionaalselt oluline
---
## RB fosforülatsioon reguleerib restriktsioonipunkti läbimist
.pull-left[
<img src="http://blogs.shu.edu/cancer/files/2014/08/figure_08_19-1024x903.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
]
.pull-right[
- Kui rakud läbivad M/G1 ülemineku, siis RB defosforüleeritakse täielikult (PP1 fosfataas)
- G1 faasis tsükliin D-CDK4/6 hüpofosforüleerib RB
- Hüpofosforüleeritud RB muutub tsükliin E-CDK2 substraadiks ja hüperfosforüleeritakse
- RB jääb hüperfosforüleerituks kogu ülejäänud raku tsükli (kuni jälle G1-ni)
]
---
## RB valgud ehk 'taskuvalgud' (*pocketproteins*)
- RB, p107 ja p130 moodustavad 'taskuvalkude' perekonna
- RB on 25% homoloogne ülejäänud kahega ja p107 ning p130 on omavahel 54% identsed
- RB *knockout* on hiirele embrüonaalselt surmav, kuid p107 või p130 *knockout* -il pole silmaga nähtavat fenotüüpi
- RB omab tugevat tuumorsupressorfunktsiooni ja p107/p130 mutatsioonid on vähkides harvad
<img src="http://www.nature.com/nrm/journal/v14/n5/images/nrm3567-i2.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
.footer[Molecular mechanisms underlying RB protein function. Frederick A. Dick & Seth M. Rubin. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 297-306 (May 2013) doi:10.1038/nrm3567]
---
## RB valgud toimivad läbi E2F
- Hüpofosforüleeritud pRB seostumine maskeerib aktivaatoritel transkriptsiooni aktivatsiooni domääni
- Repressorvalkude E2F4 ja E2F5 seostumine taskuvalkudele (peamiselt p107 ja p130) moodustab E2F märklaudgeenide promootoritele repressorkompleksid
- Hüpofosforüleeritud RB valgud seostuvad ka DNA-l olevatele E2F valkudele vaigistades niimoodi geeniekspressiooni. Kompleksi 'tõmmatakse' ka histooni deatsetülaas HDAC mis muudab kromatiini struktuuri transkriptsioonile mittepermissiivseks
- pRB seostub eelkõige E2F1-3 valkudele ning p107 ja p130 E2F4/5
.pull-left[
<img src="http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n9/images/nrm2469-i1.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
]
.pull-right[
<img src="http://www.nature.com/nrm/journal/v14/n5/images/nrm3567-f2.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
]
---
## Imetajate E2F TF perekond
- Kaheksa geeni E2F1-8, kolm toimivad aktivaatoritena (E2F1-3a) ja ülejäänud repressoritena (E2F3b-8)
- E2F1-6 valgud sisaldavad DP1,2 (*dimerization partner protein*) heterodimerisatsiooni domääni ja seostuvad DNA-le heterodimeerina koos DP valguga
- E2F1-5 valgud seovad RB 'taskuvalke' üle C-terminaalse domääni
- Taskuvalgud pRB, p107 ja p130 seovad E2F ainult hüpofosforüleeritud olekus
<img src="http://www.ijbs.com/v01/p0087/ijbsv01p0087g02.gif" width="360" style="display: block; margin: auto;" />
.footer[Pilt: Signalling In The Epidermis: The E2f Cell Cycle Regulatory Pathway In Epidermal Morphogenesis, Regeneration And Transformation, doi:10.7150/ijbs.1.87 ]
---
## pRB valkude E2F TF seostumiskoht on konserveerunud
<img src="http://genesdev.cshlp.org/content/16/24/3199/F3.large.jpg" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
- Rb tasku on konserveerunud (mida punasem seda konserveerunum) nii eri liikidel kui valgu isovormidel p107 ja p130 valkudel ([Lee et al. 1998](http://www.nature.com/nature/journal/v391/n6670/full/391859a0.html)). Kollane on E2F2 peptiid mis on seostunud taskusse.
- Tärniga nool näitab B-domäänil asuvat LxCxE-motiivi sisaldavate valkude (HPV E7) seostumiskohta ([Lee et. al 2002](http://genesdev.cshlp.org/content/16/24/3199.full))
- HPV E7 valgu seostumine RB-le rikub 'tasku' konformatsiooni nii, et see ei saa enam siduda E2F valke
---
## Transkriptsioonist sõltumatu pRb rakutsükli regulatsioon
- pRb stabiliseerib p27Kip1
- pRb vahendab ka p27 proteolüütilist lagundamist vahendava Skp2 degradatsiooni
- Skp2 on ubikvitiini ligaasi kompleksi p27 ära tundev subühik
- RB seob Skp2 üle oma C-terminaalse domääni ja esitleb selle APC/C (*anaphase-promoting complex/cyclosome*) lagundamisele
- APC seostub RB B-boxi LxCxE-motiivi sisaldavate valkude seostumiskohta
<img src="http://www.nature.com/nrm/journal/v14/n5/images/nrm3567-f3.jpg" width="400" style="display: block; margin: auto;" />
---
## pRB hüperfosforüleerimist võimendab positiivne tagasiside
G1/S faasi kiire ülemineku tagavad positiivse tagasiside mehhanismid
- **Tsükliin E transkriptsiooni reguleerib E2F** ja hüpofosforüleeritud RB repressioonist vabanev E2F võimendab edasist kiiret RB hüperfosorüleerimist läbi tsükliin E-CDK2
- **p27Kip1 on tsükliin E-CDK2 substraat** ning fosfo-p27 määratakse ubikvitiin-proteasoomsele lagundamisele
---
## Vähis mitmeid strateegiaid RB funktsiooni tasalülitamiseks, MYC
- RB geeni mutatsioonid retinoblastoomis, osteosarkoomis ja väikserakulistes kopsukasvajates
- HPV E7 seostumine pRB-le inaktiveerib selle >99.7% emakakaela vähkides
- bHLH tf **Myc** on üle ekspresseeritud 15-30% vähkides
- **Myc-Max** tf aktiveerib tsükliin D2 ja CDK4 transkriptsiooni
- Lisaks aktiveerib Myc-Max ka Cul1 transkriptsiooni, mis on SCF(SKP2) sisaldava kompleksi E3 ubikvitiin ligaas ja ubikvitineerib p-p27kip
- **Myc-Miz1** tf inhibeerib aga p15INK4B ning p21Cip1, p27Kip1 transkriptsiooni
- Myc aktiveerib E2F1/2/3 geenide transktriptsiooni
---
## Tsükliini kinaasi inhibiitorid toimivad läbi RB
- D-tsükliini inhibiitorite p15/p16 mutatsioonid ja RB mutatsioonid välistavad teineteist vähkides
<img src="figures/RBvsCDKImuts.png" width="70%" style="display: block; margin: auto;" />
.footer[Link andmetele: [RB vs CDKIs](http://magi.brown.edu/view/db47b1d08798145230a159ea3e0ffd54)]
---
## Normaalselt TGF-b supresseerib Myc ekspressiooni
Võttes arvesse Myc-i võimet p15<sup>INK4B</sup> ekspressioon kinni panna ja seega TGF-beta jagunemist kontrolliv mõju nullida, siis
- **normaalsetes rakkudes on Myc geen siiski TGF-beta raja kontrolli all**
- Smad3-4 aktiveerib koos Miz1 tf p15INK4 geeni ekspressiooni.
- SMAD3 istub koos E2F4/5 (repressiivsed E2F valgud), p107 ja C/EBPbeta valkudega Myc geeni promootoril ja paneb sellelt transkriptsiooni efektiivselt kinni.
- Vähkides on TGF-b raja mutatsioonid sagedased: Smad4 mutatsioonid, TGF-b retseptori mutatsioonid
<table class="table table-striped" style="font-size: 12px; ">
<caption style="font-size: initial !important;">Erinevates rakutüüpides CdkI üles-regulatsioon varieerub vastusena TGF-beta stimulatsioonile, kuid Myc alla-regulatsioon on universaalne.</caption>
<thead><tr>
<th style="text-align:left;"> Rakud </th>
<th style="text-align:left;"> p15INK4B </th>
<th style="text-align:left;"> p21Cip1 </th>
<th style="text-align:left;"> p57Kip2 </th>
<th style="text-align:left;"> c-MYC </th>
</tr></thead>
<tbody>
<tr>
<td style="text-align:left;"> epiteeli eellasrakud </td>
<td style="text-align:left;"> üles </td>
<td style="text-align:left;"> üles </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> alla </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> neuraalsed eellasrakud, astrotsüüdid </td>
<td style="text-align:left;"> üles </td>
<td style="text-align:left;"> üles </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> alla </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> hematopoeetilised eellasrakud </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> üles </td>
<td style="text-align:left;"> alla </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:left;"> T rakud </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> üles </td>
<td style="text-align:left;"> </td>
<td style="text-align:left;"> alla </td>
</tr>
</tbody>
</table>
---
## Molekulaarsed muutused kasvajates mis viivad rakutsükli deregulatsioonini
[Erinevat tüüpi kasvajates kuni 90% vähke sisaldab muutusi rakutsükli regulatsioonis.](cellcyclecancer.html)
</textarea>
<script src="https://remarkjs.com/downloads/remark-latest.min.js"></script>
<script>var slideshow = remark.create();
if (window.HTMLWidgets) slideshow.on('afterShowSlide', function (slide) {window.dispatchEvent(new Event('resize'));});
(function() {var d = document, s = d.createElement("style"), r = d.querySelector(".remark-slide-scaler"); if (!r) return; s.type = "text/css"; s.innerHTML = "@page {size: " + r.style.width + " " + r.style.height +"; }"; d.head.appendChild(s);})();</script>
<script type="text/x-mathjax-config">
MathJax.Hub.Config({
tex2jax: {
skipTags: ['script', 'noscript', 'style', 'textarea', 'pre']
}
});
</script>
<!-- dynamically load mathjax for compatibility with self-contained -->
<script>
(function () {
var script = document.createElement('script');
script.type = 'text/javascript';
script.src = 'https://cdn.bootcss.com/mathjax/2.7.1/MathJax.js?config=TeX-MML-AM_CHTML';
if (location.protocol !== 'file:' && /^https?:/.test(script.src))
script.src = script.src.replace(/^https?:/, '');
document.getElementsByTagName('head')[0].appendChild(script);
})();
</script>
</body>
</html>